前言
银屑病是一种以表皮增生为特征的复发炎症性皮肤病，涉及免疫细胞和角质形成细胞(KCs)之间复杂的相互作用关系。目前已经在银屑病的免疫激活方面取得了较多进展，特别是确定了IL-17A作为驱动核心参与该病理过程。又有研究表明Hippo-YAP信号通路在细胞存活和组织生长中起着至关重要的作用，其靶基因AREG可促进银屑病的发生。然而，IL-17A是否通过调节Hippo-YAP信号通路从而促进角质形成细胞增殖这一过程尚未被探索，所以，探索银屑病调节机制的空白区域对银屑病的治疗是非常重要的。
近日，同医院史玉玲教授作为通讯作者，在JournalofInvestigativeDermatology（IF=8.）杂志发表了题为“IL-17APromotesPsoriasis-AssociatedKeratinocyteProliferationthroughACT1-DependentActivationofYAP–AREGAxis”的研究论文，报道了银屑病关键细胞因子IL-17A影响皮肤角质形成细胞及其促进表皮增厚的分子机制。
研究内容
在本研究中，通过转录组测序、PCR技术、免疫印迹、免疫荧光分析以及共免疫沉淀等方法对银屑病样本进行分析探究，结果发现YAP-AREG通路在银屑病皮肤样本中被激活，并且该通路可以被IL-17A单抗（治疗剂）抑制，通过咪喹莫特(IMQ)和IL-17A诱导可以激活小鼠表皮中的YAP-AREG通路。HaCaT和正常人表皮角质形成细胞的体外研究表明，IL-17A通过激活Hippo-YAP信号传导可以增强AREG表达和角质形成细胞的增殖。从机制上讲，IL-17A刺激角质形成细胞中MST1向ACT1的募集，这导致了MST1-LATS1的相互作用和抑制YAP磷酸化。总而言之，研究结果揭示了通过激活YAP-AREG信号传导，IL-17A促进银屑病角质形成细胞增殖的机制。
研究结果
YAP-AREG通路在银屑病患者的皮肤中被激活并被IL-17A单抗抑制
通过对人类银屑病患者样本的RNA测序数据进行分析，发现YAP、TEAD4及其靶基因（包括AREG、BIRC5、CCNE1、EPGN和PLAU）的表达水平在银屑病皮肤病变中普遍上调（图a)。通过RT-qPCR分析验证了这些发现（图b）。免疫荧光检测到磷酸化YAP信号减少和YAP信号增加，尤其是在银屑病病变中几乎所有表皮KC的细胞核中（图c-d）。免疫荧光分析还揭示了表达AREG的细胞从局限于健康表皮的基底层和棘层扩展到包括银屑病病变中的所有表皮层（图d）。这些结果表明YAP信号在银屑病患者中被激活。
Secukinumab是IL-17A的拮抗剂（IL-17A单抗），近年来已报道出对银屑病的显著治疗效果。为了检查IL-17A抑制对YAP-AREG的可能影响，收集了七名银屑病患者在Secukinumab治疗前和治疗后12周的皮损皮肤组织。通过RNA-seq结果分析显示，Secukinumab给药后，AREG、BIRC5、CCNE1、CTGF和EPGN基因表达水平降低（图e）。
通过RT-qPCR分析验证AREG和BIRC5的减少（图f）。Secukinumab应用还增加了磷酸化YAP水平，但降低了患者皮肤表皮中YAP和AREG蛋白的表达（图g-h）。这些结果表明，IL-17A抑制能够减少银屑病患者皮肤中的YAP-AREG活化。
图1
银屑病中YAP-AREG信号被激活并且Secukinumab治疗能够抑制该激活过程
IMQ和IL-17A诱导小鼠皮肤组织能够激活YAP-AREG信号
对于“YAP-AREG信号参与了银屑病表皮增生过程，且与IL-17A作用密切相关”这一猜想，作者使用咪喹莫特(IMQ)诱导和IL-17A诱导的小鼠模型来进行研究测试。正如预期的那样，用IMQ治疗的小鼠出现典型的银屑病样皮肤表型，包括表皮增生，以及Il-17a和增殖标志物Mki67的显著上调；与人类样本的结果一致，在IMQ处理的小鼠损伤皮肤中可以看到Areg和蛋白质的表达升高，并且YAP信号在IMQ处理的表皮中被激活（图a-d）。
为了评估IL-17A对YAP-AREG轴的影响，将IL-17A连续6天注射到小鼠左耳皮下（右耳接受PBS作为对照）。尽管在IL-17A处理的耳朵中没有观察到明显的外部表型，但与右耳相比，IL-17A处理的耳朵的厚度显著增加（图e-g）。重要的是，IL-17A处理导致Mki67和AREG的表达显著增加（图h-i），并降低了磷酸化YAP的水平并提高了耳表皮中的总YAP水平（图j）。
这些结果表明，在IMQ治疗的小鼠模型中，IL-17A诱导的角质细胞（KCs）过度增殖且伴随着YAP-AREG通路的激活。
图2
YAP-AREG信号在IL-17A作为其关键调节因子的IMQ诱导的银屑病小鼠模型中升高
IL-17A通过激活HaCaT细胞中的Hippo-YAP信号增强AREG表达并促进细胞增殖
为了进一步研究IL-17A对HippoYAP信号传导的影响，用IL-17A刺激HaCaT细胞、NHEK细胞。结果发现，增殖标记物MKI67水平升高，而分化标记物（FLG、IVL、LOR、KRT1和KRT10）表达水平则下调（图a）。值得注意的是，在IL-17AEA处理的HaCaT细胞中，AREG表达水平和培养上清液浓度显著增加（图b-c）。细胞计数分析表明，IL-17A促进HaCaT细胞的增殖，小干扰RNA（siRNA）介导的AREG沉默基本上消除了这种效应（图d）。因此，IL-17A的KCs增殖增强作用依赖于AREG。
此外，为了检测IL-17A是否改变HaCaT细胞中的YAP信号，作者通过WB分析、免疫印迹、免疫荧光分析和共免疫沉淀等分析，结果表明IL-17A能够激活Hippo-YAP信号通路，抑制YAP的降解，促进细胞核内YAP的分布以及与转录因子TEAD4的相互作用，最终上调效应分子AREG的表达和分泌（图e-l）。
总之，这些结果证明了IL-17A通过激活HaCaT细胞中的Hippo-YAP信号来增强AREG表达并促进细胞增殖。
图3
IL-17A通过Hippo-YAP通路上调AREG表达并促进角质形成细胞增殖
沉默ACT1能够阻断IL-17A对于YAP-AREG信号的调控作用
ACT1是已知的IL-17R信号传导的细胞内适配器，为了探索ACT1在IL-17A促进AREG表达和角质形成细胞增殖中的作用，作者通过沉默ACT1基因表达，发现AREG的表达和分泌上调，以及IL-17A处理后细胞增殖的上调，在很大程度上被ACT1缺失逆转（图a-h）。为了确定ACT1是否参与了IL-17A诱导的Hippo-YAP信号的激活，作者通过检测关键信号成分的水平和磷酸化水平，在HaCaT和NHEK细胞中，ACT1敲除使IL-17AE诱导的磷酸化YAP和MST1/2的减少被逆转，并阻断IL-17A诱导的YAP核积累上调（图i-m）。值得注意的是，ACT1缺失也消除了IL17A诱导的YAP和TEAD4之间的相互作用（图n）。
图4
沉默ACT1能够阻断IL-17A对于YAP-AREG信号的调控作用
IL-17A通过将MST1招募到ACT1来激活YAP信号
为了阐明IL-17A激活YAP信号的分子机制，通过共免疫沉淀分析、细胞转染和基因敲除等实验，以验证ACT1可以在IL-17A存在的情况下直接招募MST1的假设。结果发现，IL-17A刺激HaCaT细胞导致ACT1和MST1之间的相互作用短暂增强，而MST1和LATS1之间的相互作用明显受损，IL-17A增强了HA标记的MST1和His标记的ACT1之间的相互作用，但减弱了HA标记的MST1和LATS1之间的相互作用，被IL-17A处理削弱的MST11相互作用可以通过ACT1缺失得以恢复（图a-c）。
这些结果揭示了以往未有报道的IL-17Rs信号适配器ACT1和Hippo信号之间的相互作用。研究表明，IL-17A可能通过将MST1招募到ACT1并破坏Hippo信号的磷酸化来激活Hippo-YAP信号。
图5
IL-17A通过招募MST1至ACT1进而激活Hippo-YAP信号通路
研究结论
(1)本研究结果表明银屑病中IL-17A通过ACT1激活Hippo-YAP信号通路，启动AREG的表达分泌，最终促进了角质形成细胞的增殖和表皮增厚过程。
(2)本研究为银屑病中IL-17A促进角质形成细胞增殖并引起表皮异常增厚的临床现象提供了科学的分子机制解释。
同济医院余增洋博士、于倩博士和许辉博士为共同第一作者。文章中转录组测序及分析服务由欧易生物完成。
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